0 引言 Introduction
随着全世界社会经济的高速发展，广大人民的生活水平不断提高，人们饮食结构的不断变化，生活节奏的持续加快及多坐少动的日常习惯等诸多不利于身体健康的行为，导致全球糖尿病的患病率迅速增长。糖尿病目前已经成为了全球性的卫生问题。
糖尿病是一种与体内代谢相关的全身性疾病，患者中以2 型糖尿病为主。骨质疏松症是一种系统性的骨骼疾病，其主要以骨质量减低、骨细微结构破坏、骨强度降低及骨质风险升高为特点[1]。在临床中，糖尿病和骨质疏松症既是两种相对独立的慢性疾病，但又不可分割[2]。半个多世纪前有学者就认为糖尿病与骨质疏松有关，1948 年有学者发现糖尿病与骨量丢失、骨质疏松相关，并首次提出糖尿病骨减少的概念[3]。糖尿病性骨质疏松属于继发性骨质疏松，是糖尿病在骨骼系统中出现的最常见的一种并发症。目前，2 型糖尿病已确认是引起骨骼损伤及骨脆性增加的独立危险因素[4-7]。近年来，国内外的调查结果显示糖尿病性骨质疏松的发病率约占糖尿病患者的50%以上[8-9]，国内李贵英等[9]报告能占55.9%，其发病率远远高于其他并发症，且有逐年增高趋势。糖尿病性骨质疏松的发病率呈逐年上升趋势，其高致残率明显降低患者的生活质量，同时也带来极大的社会经济负担[10-11]。
动物模型的建立对进一步明确糖尿病性骨质疏松症的特点及机制的深入研究具有重大意义。对于大鼠糖尿病性骨质疏松症模型的建立，目前尚未有统一的标准建模方法，并且对建造的模型未进行深入的相关鉴定研究。因此，此次实验旨在通过建造大鼠糖尿病性骨质疏松模型，并对该模型进行相关鉴定，为后期进一步明确糖尿病性骨质疏松症的特点及机制的深入研究奠定基础，同时也为糖尿病性骨质疏松症患者的骨组织工程研究奠定相关的实验基础。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 建立动物模型。
1.2 时间及地点 实验于2019 年1 至10 月在西南医科大学口腔医学院口颌面修复重建与再生实验室完成。
1.3 材料1.3.1 实验动物 7周龄雄性SD大鼠32只，体质量(238±12) g，购于西南医科大学基础医学部实验动物中心，动物许可证号：SCXK(川)2018-17。大鼠自由摄食、摄水，饲养室室温(22±2)℃，湿度48%，昼夜12 h。
1.3.2 实验用主要饲料、药品、试剂和仪器 高脂高糖饲料[开源动物饲料(常州)有限公司]；链脲佐菌素(美国 Sigma公司)；柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 ( 美国雅培公司)；苏木精-伊红(北京索莱宝科技有限公司产品)；血糖仪及血糖试纸(德国罗氏诊断公司)；电子天平(上海速展计量仪器有限公司)；光学显微镜(Olympus BX51，日本)；石蜡切片机(Leica，德国)；Micro-CT(Scanco viva40，瑞士)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组 将32 只大鼠测量体质量，根据体质量采用随机数字表法随机分为模型组与对照组，每组16 只，每组大鼠随机分为4 笼，每笼各4 只。
1.4.2 建立大鼠2 型糖尿病性骨质疏松模型 模型组给予高脂高糖饲料，对照组给予普通饲料，喂养4 周。
(1)配制链脲佐菌素(STZ)：首先配置0.1 mmol/L 柠檬酸缓冲液：将柠檬酸与柠檬酸钠分别2.0 g 与2.94 g 各溶解于100 mL 生理盐水中，使其浓度为0.1 mmol/L，各取75 mL，充分混合后测定pH 值，调节pH，保持pH 值为4.2，保存于4 ℃冰箱待用，临用前将链脲佐菌素溶解在已配置0.1 mmol/L 柠檬酸缓冲液中，形成浓度为0.3%链脲佐菌素溶液，配置后使用锡箔纸进行遮光保护。
(2)给药方式：两组大鼠均禁食12 h，模型组大鼠行一次性腹腔注射链脲佐菌素(35 mg/kg，注射1 次)，链脲佐菌素在使用前配置，使用过程中用锡箔纸进行遮光保护。对照组给予柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(10 mL/kg)一次性腹腔注射。注射后将大鼠放置回原笼中正常饲养，适宜条件下(室温20-25 ℃、相对湿度60%-80%)自由饮水、摄食，常规喂养(给予普通饲料)。
实验动物造模过程的相关问题造模目的： 建立大鼠2 型糖尿病性骨质疏松模型借鉴已有标准实施动物造模：高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立大鼠2 型糖尿病性骨质疏松模型研究问题需要改进动物模型方法及意义：快速建立一个稳定的糖尿病性骨质疏松模型对深入研究糖尿病性骨质疏松的发病机制及治疗方法至关重要。单纯给予高脂高糖饮食诱导建立糖尿病骨质疏松症症模型时间较长，费用高，成模稳定性较差动物来源及品系： 雄性SD 大鼠购于西南医科大学基础医学部实验动物中心造模技术描述： 模型组大鼠处理：(1)给予高脂高糖饲料，喂养4 周；(2)大鼠禁食12 h，行一次性腹腔注射链脲佐菌素(35 mg/kg)，链脲佐菌素在使用前配置，使用过程中用锡箔纸进行遮光保护造模主要诱导用药： 链脲佐菌素动物数量及分组方法：根据大鼠体质量采用随机数字表法随机分为模型组和对照组，每组16 只造模成功评价指标：于注射链脲佐菌素后 3，7，10，14，21 d 测量大鼠空腹血糖，连续3 次测得空腹血糖均≥ 16.7 mmol/L，则为糖尿病造模成功[11-12]造模后实验观察指标：①两组大鼠造模前后体质量及空腹血糖水平；②胰岛组织苏木精伊红染色结果；③大鼠胫骨Micro-CT 扫描结果；④股骨组织切片分析结果造模后动物处理： 造模前及造模后3，7，10，14，21 d 空腹状态下测量大鼠体质量及血糖值；于注射链脲佐菌素8 周后，过量麻醉处死大鼠，取大鼠胰岛组织、双侧股骨及胫骨，进行相关指标检测伦理委员会批准： 实验方案经西南医科大学动物实验伦理委员会批准
1.4.3 生命体征观察 造模前及造模后每日对模型组和对照组大鼠的生命体征及一般状况进行观察比较，主要观察大鼠的食量、尿量、毛发、精神状态等指标，观察并记录。
1.4.4 大鼠尾静脉血糖及体质量测量 测量时保证大鼠在安静、温暖、通风、熟悉的环境下实施，给药前及给药后3，7，10，14，21 d，在空腹状态下测体质量及剪尾取血，测其血糖值，每次每一只均测量3 次，取其平均值，作为最终结果并纪录统计，每次测量前后对大鼠尾部均采用碘伏进行消毒。
1.4.5 糖尿病成功检测标准 模型组大鼠一次性左下腹腔注射链脲佐菌素(35 mg/kg)后，于3，7，10，14，21 d 后测量大鼠空腹血糖，连续3 次测得空腹血糖均≥ 16.7 mmol/L，则为糖尿病造模成功[11-12]。
1.4.6 胰岛组织切片观察 在分别注射链脲佐菌素和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液8 周后，采用注射过量 1%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉药物法处死大鼠。分别解剖出两组大鼠胰岛组织，并将其固定于 40 g/L 多聚甲醛溶液中，然后均制备苏木精-伊红染色切片。
1.4.7 胫骨Micro-CT 分析 给药8 周后处死大鼠，在无菌条件下解剖胰岛组织时，同时取下大鼠双侧股骨及胫骨，剔除股骨及胫骨表面肌肉及骨膜，迅速放入新鲜配制的40 g/L 多聚甲醛固定液中进行固定，4 ℃固定24 h 后取出；采用Micro-CT机扫描胫骨干骺端，观察骨组织结构。扫描条件为：电压80 kV； 电流 500 μA；分辨率10.5 μm，曝光时间200 ms，扫描的层数1 200 层。用三维重建处理对两组大鼠胫骨骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)进行检测。
1.4.8 股骨组织学分析 采用PBS 多次充分清洗固定后的大鼠股骨组织，清洗后放入4 ℃ 10%EDTA(pH 8.0)的溶液中，进行脱钙。20 d 后，待骨组织脱钙完全，常规用乙醇进行梯度脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，连续纵行组织切片，厚5 μm，制备切片，进行Masson 染色及苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察两组大鼠骨组织结构。
1.5 主要观察指标 ①两组大鼠造模前后体质量及空腹血糖水平；②胰岛组织切片观察结果；③大鼠胫骨Micro-CT 扫描结果；④股骨组织切片分析结果。
1.6 统计学分析 采用SPSS 17 统计软件进行分析。收集每次测量体质量及血糖的数据，将所有数据进行正态性检验，其中正态分布或近似正态分布的计量资料描述以±s表示，正态分布采用两样本的t检验，若方差不齐采用t检验，非正态分布数据者采用秩和检验。其余数据进行单因素方差分析，计算结果以±s形式表示，检验水准取值 0.05(α=0.05)，P＜ 0.05为差异有显著性意义。
2 结果 Results
2.1 实验动物数量分析 对照组16 只进入结果分析，模型组造模成功12 只进入结果分析。
2.2 两组大鼠一般状况 对照组大鼠在注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液后生长良好，体质量逐渐增加，毛发整齐光亮，精神状态良好，血糖稳定在正常范围之内，并且无其他症状的出现。模型组大鼠在注射链脲佐菌素后，每日食量、饮水量及尿量明显逐渐增加，体型逐渐消瘦，精神不振，反应及活动明显迟钝，毛发明显蓬散杂乱，大鼠逐渐表现为三多一少的糖尿病症状。
2.3 造模前后两组大鼠体质量比较 与对照组相比，模型组大鼠体质量明显降低(P＜ 0.05)，差异有显著性意义。见表1。
表1 ｜造模前后两组大鼠体质量比较 (±s，g)Table 1 ｜Comparison of the body mass of rats between two groups before and after modeling表注：与对照组比较，aP＜ 0.05时间 对照组(n=16) 模型组(n=12)注射前 328.2.2±20.2 336.0±27.3注射后3 d 330.7±20.2 320.92±21.9a注射后7 d 334.7±18.7 315.02±20.8a注射后10 d 339.9±18.0 310.22±24.6a注射后14 d 343.8±17.8 327.5±20.7a注射后21 d 355.3±20.4 338.5±21.3a
2.4 两组大鼠空腹血糖水平 与对照组大鼠空腹血糖相比较，模型组大鼠空腹血糖在注射链脲佐菌素后明显升高(P＜0.001)，差异有显著性意义。见表2。
2.5 胰岛组织切片观察 造模后8 周两组大鼠胰岛组织切片木精-伊红染色见图1。与对照组相比，模型组胰岛细胞明显稀疏。
2.6 Micro-CT 检测结果 造模后8 周两组大鼠胫骨Micro-CT扫描及三维重建见图2,3。对照组大鼠骨组织皮质骨均匀，骨小梁较为致密；与对照组相比模型组大鼠皮质骨增厚，骨髓腔明显增大，骨小梁断裂并且稀疏。
2.7 股骨组织切片分析结果 造模8 周两组大鼠股骨苏木精-伊红染色切片镜下观与Masson 染色切片镜下观察见图4。
表2 ｜造模前后两组大鼠血糖水平比较 (±s，mmol/L)Table 2 ｜Comparison of the blood glucose levels of rats between the two groups before and after modeling表注：与正常对照组比较，aP＜ 0.05时间 对照组(n=16) 模型组(n=12)注射前 4.6±0.4 4.7±0.47注射后3 d 4.7±0.2 23.0±4.4a注射后7 d 4.7±0.2 19.4±3.3a注射后10 d 4.8±0.2 19.3±3.3a注射后14 d 4.7±0.3 20.1±4.1a注射后21 d 4.9±0.2 19.1±3.2a
图1 ｜造模后8 周两组大鼠胰岛组织切片苏木精-伊红染色(×100)Figure 1 ｜Hematoxylin-eosin staining of pancreatic islet tissue at 8 weeks after modeling in the two groups (×100)图注：图A 为对照组；B 为模型组。与对照组相比，模型组胰岛细胞明显稀疏
图2 ｜两组大鼠胫骨Micro-CT 扫描及三维重建Figure 2 ｜Micro-CT scan and three-dimensio
nal reco
nstruction of the rat tibia in the two groups图注：对照组大鼠骨组织皮质骨均匀，骨小梁较为致密；与对照组相比模型组大鼠骨髓腔明显增大，骨小梁断裂并且稀疏
图3 ｜两组大鼠胫骨Micro-CT 扫描数据分析Figure 3 ｜Micro-CT scan data of the rat tibia in the two groups图注：aP＜ 0.05
图4 ｜造模后8 周两组大鼠股骨苏木精-伊红染色及Masson 染色观察(×20)Figure 4 ｜Hematoxylin-eosin staining and Masson staining of the ratfemur at 8 weeks after modeling (×20)图注：图A(对照组)，B(模型组)为苏木精-伊红染色；C(对照组)，D(模型组)为Masson 染色。对照组大鼠骨小梁清晰，排列密集，骨小梁间距较小；与对照组相比模型组大鼠小梁稀疏，排列紊乱，骨小梁间距较大
3 讨论 Discussion
糖尿病是一组以血糖浓度高为特征的慢性疾病，糖尿病患者中大部分为2 型糖尿病，胰岛素抵抗是其发生的主要因素[13]。2 型糖尿病并发症较多且严重，其中糖尿病骨质疏松症是其主要并发症之一。糖尿病性骨质疏松的发病率逐年上升，但其的发病机制目前尚未能明确，如今认为与高糖状态下出现血钙水平异常，导致骨代谢异常等多种因素相关[14]。所以快速建立一个稳定的糖尿病性骨质疏松模型对深入研究糖尿病性骨质疏松的发病机制及治疗方法至关重要。高糖食物可造成动物模型高胰岛素血症，而高脂肪食物可导致动物模型胰岛素分泌功能减退，使机体糖耐量降低[15]，通过高脂高糖喂养可形成胰岛素抵抗，并导致高胰岛素血症的形成。单纯给予高脂高糖饮食诱导建立糖尿病骨质疏松症模型时间较长，费用高，成模稳定性较差。
链脲佐菌素是一种广谱抗菌素，具有抗菌、抗肿瘤的作用，同时研究发现其对动物胰岛β 细胞具有特异性的毒性作用，其作用机制是选择性损伤胰岛B 细胞，导致胰岛素分泌减少[7]。大鼠采用高脂高糖饮食诱导4 周后，会产生胰岛素抵抗，即表现为其胰岛素受体与胰岛素的结合能力减弱，当分泌相同剂量的胰岛素时，产生降低血糖的效应也会降低[16-18]。虽然胰岛素抵抗最终也会表现出高血糖的体征，但此过程需要较长的时间才能够出现。大多数糖尿病动物模型建立实验，对时间都会有所要求，都希望能够缩短实验时间，所以模型组采用高糖高脂饮食诱导和药物干预相结合的方法 ，将成年SD 大鼠高糖高脂饮食诱导一段时间，以诱导出胰岛素抵抗，再联合腹腔注射小剂量的链脲佐菌素，以此来加速糖尿病的进程，最终建立2 型糖尿病大鼠模型，该方法具有制造方法简便、药物毒性低、特异性高等优点。
经典的糖尿病诊断标准为：典型糖尿病症状(多饮、多尿、多食、不明原因的体质量下降)加上随机血糖≥11.1 mmol/L或加上空腹血糖≥7.0 mmol/L[19-20]。对于此次实验糖尿病的诊断，研究选择在造模后3，7，10，14，21 d，对模型组大鼠的体质量及血糖进行测量及造模前、造模后每日对大鼠生命体征等一般状况进行观察比较，结果表明模型组大鼠血糖明显升高，体质量呈现出先下降、后稍回升的趋势，体型消瘦，每日饮水量、饮食量及尿量明显增多；造模后3，7，10，14，21 d 后连续3 次测得空腹血糖均≥ 16.7 mmol/L；这些生命体征表现都与临床上 2 型糖尿病患者的临床表现及症状相近。以上结果说明了模型组大鼠已具有了糖尿病症状及表现，并且模型组大鼠的发病过程及临床表现与2 型糖尿病相类似，这与实验的预期结果相同。由于2 型糖尿病具有较多的发病原因，因此无论是诱导性、自发性、遗传性还是转基因动物模型，都不可能将糖尿病的发病及发展过程完全表现出来[21]。而此次实验通过给予高糖高脂饮食并结合链脲佐菌素建立了大鼠糖尿病模型，该模型的发病过程及临床表现与人类糖尿病相类似，因而可以用于糖尿病及其并发症的相关研究。此外，该模型动物不需要使用药物来维持生命时间，这与其他实验相比较，具有独特优势，虽然部分模型大鼠血糖与之前比较稍有所降低，但仍然高于对照组的正常水平，这与临床上2 型糖尿病患者早期通过减轻体质量来改善胰岛素抵抗的表现相类似。
目前对骨质疏松的评价，DEXA 法测量骨密度是大多数相关报道的常用评价方法，但是此方法存在不能完全体现骨强度的变化以及无法反映骨结构的缺点[22]。目前也有相关文献报道采用 Micro-CT 扫描技术来评价小动物骨质疏松症。Micro-CT 检查是一种非侵入性、非破坏性的高分辨率检查骨骼微结构的方法[23]。此次实验亦采用Micro-CT 扫描技术来评价大鼠的骨质疏松症，一方面，Micro-CT 能够将大鼠骨骼的三维解剖结构清晰地呈现出来，从不同角度观察大鼠骨质的变化；另一方面，通过Micro-CT 扫描，可以测定大鼠的骨体积、骨小梁数量及骨小梁间距值，通过统计学分析，模型组与对照组比较，差异有显著性意义。实验对骨质疏松症鉴定的另外一个方法为制作股骨组织切片，造模后8 周，取两组大鼠股骨组织切片进行苏木精-伊红染色和Masson 染色，通过比较发现，与对照组相比，模型组大鼠骨髓腔明显增大、骨小梁间距明显加宽，骨小梁变细、断裂，骨小梁之间明显疏松紊乱，这些均是典型的骨质疏松改变，与Micro-CT 扫描结果相一致，证明了骨质疏松模型建立的成功。
综上所述，从形态学、组织学、影像学等几方面结果可以得出，高糖高脂饮食诱导联合小剂量链脲佐菌素(35 mg/kg)可以成功建立2 型糖尿病骨质疏松症大鼠模型，该模型的建立为后续研究糖尿病骨代谢奠定了基础。
作者贡献：通讯作者设计实验并负责论文审校，第一作者进行实验实施及撰写论文，其他作者均为实验参与者。
经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金项目(81870746，81371125)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。
机构伦理问题：实验方案经西南医科大学动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。
文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。
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0 引言 Introduction随着全世界社会经济的高速发展，广大人民的生活水平不断提高，人们饮食结构的不断变化，生活节奏的持续加快及多坐少动的日常习惯等诸多不利于身体健康的行为，导致全球糖尿病的患病率迅速增长。糖尿病目前已经成为了全球性的卫生问题。糖尿病是一种与体内代谢相关的全身性疾病，患者中以2 型糖尿病为主。骨质疏松症是一种系统性的骨骼疾病，其主要以骨质量减低、骨细微结构破坏、骨强度降低及骨质风险升高为特点[1]。在临床中，糖尿病和骨质疏松症既是两种相对独立的慢性疾病，但又不可分割[2]。半个多世纪前有学者就认为糖尿病与骨质疏松有关，1948 年有学者发现糖尿病与骨量丢失、骨质疏松相关，并首次提出糖尿病骨减少的概念[3]。糖尿病性骨质疏松属于继发性骨质疏松，是糖尿病在骨骼系统中出现的最常见的一种并发症。目前，2 型糖尿病已确认是引起骨骼损伤及骨脆性增加的独立危险因素[4-7]。近年来，国内外的调查结果显示糖尿病性骨质疏松的发病率约占糖尿病患者的50%以上[8-9]，国内李贵英等[9]报告能占55.9%，其发病率远远高于其他并发症，且有逐年增高趋势。糖尿病性骨质疏松的发病率呈逐年上升趋势，其高致残率明显降低患者的生活质量，同时也带来极大的社会经济负担[10-11]。动物模型的建立对进一步明确糖尿病性骨质疏松症的特点及机制的深入研究具有重大意义。对于大鼠糖尿病性骨质疏松症模型的建立，目前尚未有统一的标准建模方法，并且对建造的模型未进行深入的相关鉴定研究。因此，此次实验旨在通过建造大鼠糖尿病性骨质疏松模型，并对该模型进行相关鉴定，为后期进一步明确糖尿病性骨质疏松症的特点及机制的深入研究奠定基础，同时也为糖尿病性骨质疏松症患者的骨组织工程研究奠定相关的实验基础。1 材料和方法 Materials and methods1.1 设计 建立动物模型。1.2 时间及地点 实验于2019 年1 至10 月在西南医科大学口腔医学院口颌面修复重建与再生实验室完成。1.3 材料1.3.1 实验动物 7周龄雄性SD大鼠32只，体质量(238±12) g，购于西南医科大学基础医学部实验动物中心，动物许可证号：SCXK(川)2018-17。大鼠自由摄食、摄水，饲养室室温(22±2)℃，湿度48%，昼夜12 h。1.3.2 实验用主要饲料、药品、试剂和仪器 高脂高糖饲料[开源动物饲料(常州)有限公司]；链脲佐菌素(美国 Sigma公司)；柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液 ( 美国雅培公司)；苏木精-伊红(北京索莱宝科技有限公司产品)；血糖仪及血糖试纸(德国罗氏诊断公司)；电子天平(上海速展计量仪器有限公司)；光学显微镜(Olympus BX51，日本)；石蜡切片机(Leica，德国)；Micro-CT(Scanco viva40，瑞士)。1.4 实验方法1.4.1 实验分组 将32 只大鼠测量体质量，根据体质量采用随机数字表法随机分为模型组与对照组，每组16 只，每组大鼠随机分为4 笼，每笼各4 只。1.4.2 建立大鼠2 型糖尿病性骨质疏松模型 模型组给予高脂高糖饲料，对照组给予普通饲料，喂养4 周。(1)配制链脲佐菌素(STZ)：首先配置0.1 mmol/L 柠檬酸缓冲液：将柠檬酸与柠檬酸钠分别2.0 g 与2.94 g 各溶解于100 mL 生理盐水中，使其浓度为0.1 mmol/L，各取75 mL，充分混合后测定pH 值，调节pH，保持pH 值为4.2，保存于4 ℃冰箱待用，临用前将链脲佐菌素溶解在已配置0.1 mmol/L 柠檬酸缓冲液中，形成浓度为0.3%链脲佐菌素溶液，配置后使用锡箔纸进行遮光保护。(2)给药方式：两组大鼠均禁食12 h，模型组大鼠行一次性腹腔注射链脲佐菌素(35 mg/kg，注射1 次)，链脲佐菌素在使用前配置，使用过程中用锡箔纸进行遮光保护。对照组给予柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(10 mL/kg)一次性腹腔注射。注射后将大鼠放置回原笼中正常饲养，适宜条件下(室温20-25 ℃、相对湿度60%-80%)自由饮水、摄食，常规喂养(给予普通饲料)。实验动物造模过程的相关问题造模目的： 建立大鼠2 型糖尿病性骨质疏松模型借鉴已有标准实施动物造模：高脂高糖饮食结合链脲佐菌素建立大鼠2 型糖尿病性骨质疏松模型研究问题需要改进动物模型方法及意义：快速建立一个稳定的糖尿病性骨质疏松模型对深入研究糖尿病性骨质疏松的发病机制及治疗方法至关重要。单纯给予高脂高糖饮食诱导建立糖尿病骨质疏松症症模型时间较长，费用高，成模稳定性较差动物来源及品系： 雄性SD 大鼠购于西南医科大学基础医学部实验动物中心造模技术描述： 模型组大鼠处理：(1)给予高脂高糖饲料，喂养4 周；(2)大鼠禁食12 h，行一次性腹腔注射链脲佐菌素(35 mg/kg)，链脲佐菌素在使用前配置，使用过程中用锡箔纸进行遮光保护造模主要诱导用药： 链脲佐菌素动物数量及分组方法：根据大鼠体质量采用随机数字表法随机分为模型组和对照组，每组16 只造模成功评价指标：于注射链脲佐菌素后 3，7，10，14，21 d 测量大鼠空腹血糖，连续3 次测得空腹血糖均≥ 16.7 mmol/L，则为糖尿病造模成功[11-12]造模后实验观察指标：①两组大鼠造模前后体质量及空腹血糖水平；②胰岛组织苏木精伊红染色结果；③大鼠胫骨Micro-CT 扫描结果；④股骨组织切片分析结果造模后动物处理： 造模前及造模后3，7，10，14，21 d 空腹状态下测量大鼠体质量及血糖值；于注射链脲佐菌素8 周后，过量麻醉处死大鼠，取大鼠胰岛组织、双侧股骨及胫骨，进行相关指标检测伦理委员会批准： 实验方案经西南医科大学动物实验伦理委员会批准1.4.3 生命体征观察 造模前及造模后每日对模型组和对照组大鼠的生命体征及一般状况进行观察比较，主要观察大鼠的食量、尿量、毛发、精神状态等指标，观察并记录。1.4.4 大鼠尾静脉血糖及体质量测量 测量时保证大鼠在安静、温暖、通风、熟悉的环境下实施，给药前及给药后3，7，10，14，21 d，在空腹状态下测体质量及剪尾取血，测其血糖值，每次每一只均测量3 次，取其平均值，作为最终结果并纪录统计，每次测量前后对大鼠尾部均采用碘伏进行消毒。1.4.5 糖尿病成功检测标准 模型组大鼠一次性左下腹腔注射链脲佐菌素(35 mg/kg)后，于3，7，10，14，21 d 后测量大鼠空腹血糖，连续3 次测得空腹血糖均≥ 16.7 mmol/L，则为糖尿病造模成功[11-12]。1.4.6 胰岛组织切片观察 在分别注射链脲佐菌素和柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液8 周后，采用注射过量 1%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉药物法处死大鼠。分别解剖出两组大鼠胰岛组织，并将其固定于 40 g/L 多聚甲醛溶液中，然后均制备苏木精-伊红染色切片。1.4.7 胫骨Micro-CT 分析 给药8 周后处死大鼠，在无菌条件下解剖胰岛组织时，同时取下大鼠双侧股骨及胫骨，剔除股骨及胫骨表面肌肉及骨膜，迅速放入新鲜配制的40 g/L 多聚甲醛固定液中进行固定，4 ℃固定24 h 后取出；采用Micro-CT机扫描胫骨干骺端，观察骨组织结构。扫描条件为：电压80 kV； 电流 500 μA；分辨率10.5 μm，曝光时间200 ms，扫描的层数1 200 层。用三维重建处理对两组大鼠胫骨骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)进行检测。1.4.8 股骨组织学分析 采用PBS 多次充分清洗固定后的大鼠股骨组织，清洗后放入4 ℃ 10%EDTA(pH 8.0)的溶液中，进行脱钙。20 d 后，待骨组织脱钙完全，常规用乙醇进行梯度脱水、二甲苯透明，石蜡包埋，连续纵行组织切片，厚5 μm，制备切片，进行Masson 染色及苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察两组大鼠骨组织结构。1.5 主要观察指标 ①两组大鼠造模前后体质量及空腹血糖水平；②胰岛组织切片观察结果；③大鼠胫骨Micro-CT 扫描结果；④股骨组织切片分析结果。1.6 统计学分析 采用SPSS 17 统计软件进行分析。收集每次测量体质量及血糖的数据，将所有数据进行正态性检验，其中正态分布或近似正态分布的计量资料描述以±s表示，正态分布采用两样本的t检验，若方差不齐采用t检验，非正态分布数据者采用秩和检验。其余数据进行单因素方差分析，计算结果以±s形式表示，检验水准取值 0.05(α=0.05)，P＜ 0.05为差异有显著性意义。2 结果 Results2.1 实验动物数量分析 对照组16 只进入结果分析，模型组造模成功12 只进入结果分析。2.2 两组大鼠一般状况 对照组大鼠在注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液后生长良好，体质量逐渐增加，毛发整齐光亮，精神状态良好，血糖稳定在正常范围之内，并且无其他症状的出现。模型组大鼠在注射链脲佐菌素后，每日食量、饮水量及尿量明显逐渐增加，体型逐渐消瘦，精神不振，反应及活动明显迟钝，毛发明显蓬散杂乱，大鼠逐渐表现为三多一少的糖尿病症状。2.3 造模前后两组大鼠体质量比较 与对照组相比，模型组大鼠体质量明显降低(P＜ 0.05)，差异有显著性意义。见表1。表1 ｜造模前后两组大鼠体质量比较 (±s，g)Table 1 ｜Comparison of the body mass of rats between two groups before and after modeling表注：与对照组比较，aP＜ 0.05时间 对照组(n=16) 模型组(n=12)注射前 328.2.2±20.2 336.0±27.3注射后3 d 330.7±20.2 320.92±21.9a注射后7 d 334.7±18.7 315.02±20.8a注射后10 d 339.9±18.0 310.22±24.6a注射后14 d 343.8±17.8 327.5±20.7a注射后21 d 355.3±20.4 338.5±21.3a2.4 两组大鼠空腹血糖水平 与对照组大鼠空腹血糖相比较，模型组大鼠空腹血糖在注射链脲佐菌素后明显升高(P＜0.001)，差异有显著性意义。见表2。2.5 胰岛组织切片观察 造模后8 周两组大鼠胰岛组织切片木精-伊红染色见图1。与对照组相比，模型组胰岛细胞明显稀疏。2.6 Micro-CT 检测结果 造模后8 周两组大鼠胫骨Micro-CT扫描及三维重建见图2,3。对照组大鼠骨组织皮质骨均匀，骨小梁较为致密；与对照组相比模型组大鼠皮质骨增厚，骨髓腔明显增大，骨小梁断裂并且稀疏。2.7 股骨组织切片分析结果 造模8 周两组大鼠股骨苏木精-伊红染色切片镜下观与Masson 染色切片镜下观察见图4。表2 ｜造模前后两组大鼠血糖水平比较 (±s，mmol/L)Table 2 ｜Comparison of the blood glucose levels of rats between the two groups before and after modeling表注：与正常对照组比较，aP＜ 0.05时间 对照组(n=16) 模型组(n=12)注射前 4.6±0.4 4.7±0.47注射后3 d 4.7±0.2 23.0±4.4a注射后7 d 4.7±0.2 19.4±3.3a注射后10 d 4.8±0.2 19.3±3.3a注射后14 d 4.7±0.3 20.1±4.1a注射后21 d 4.9±0.2 19.1±3.2a图1 ｜造模后8 周两组大鼠胰岛组织切片苏木精-伊红染色(×100)Figure 1 ｜Hematoxylin-eosin staining of pancreatic islet tissue at 8 weeks after modeling in the two groups (×100)图注：图A 为对照组；B 为模型组。与对照组相比，模型组胰岛细胞明显稀疏图2 ｜两组大鼠胫骨Micro-CT 扫描及三维重建Figure 2 ｜Micro-CT scan and three-dimensio
nal reco
nstruction of the rat tibia in the two groups图注：对照组大鼠骨组织皮质骨均匀，骨小梁较为致密；与对照组相比模型组大鼠骨髓腔明显增大，骨小梁断裂并且稀疏图3 ｜两组大鼠胫骨Micro-CT 扫描数据分析Figure 3 ｜Micro-CT scan data of the rat tibia in the two groups图注：aP＜ 0.05图4 ｜造模后8 周两组大鼠股骨苏木精-伊红染色及Masson 染色观察(×20)Figure 4 ｜Hematoxylin-eosin staining and Masson staining of the ratfemur at 8 weeks after modeling (×20)图注：图A(对照组)，B(模型组)为苏木精-伊红染色；C(对照组)，D(模型组)为Masson 染色。对照组大鼠骨小梁清晰，排列密集，骨小梁间距较小；与对照组相比模型组大鼠小梁稀疏，排列紊乱，骨小梁间距较大3 讨论 Discussion糖尿病是一组以血糖浓度高为特征的慢性疾病，糖尿病患者中大部分为2 型糖尿病，胰岛素抵抗是其发生的主要因素[13]。2 型糖尿病并发症较多且严重，其中糖尿病骨质疏松症是其主要并发症之一。糖尿病性骨质疏松的发病率逐年上升，但其的发病机制目前尚未能明确，如今认为与高糖状态下出现血钙水平异常，导致骨代谢异常等多种因素相关[14]。所以快速建立一个稳定的糖尿病性骨质疏松模型对深入研究糖尿病性骨质疏松的发病机制及治疗方法至关重要。高糖食物可造成动物模型高胰岛素血症，而高脂肪食物可导致动物模型胰岛素分泌功能减退，使机体糖耐量降低[15]，通过高脂高糖喂养可形成胰岛素抵抗，并导致高胰岛素血症的形成。单纯给予高脂高糖饮食诱导建立糖尿病骨质疏松症模型时间较长，费用高，成模稳定性较差。链脲佐菌素是一种广谱抗菌素，具有抗菌、抗肿瘤的作用，同时研究发现其对动物胰岛β 细胞具有特异性的毒性作用，其作用机制是选择性损伤胰岛B 细胞，导致胰岛素分泌减少[7]。大鼠采用高脂高糖饮食诱导4 周后，会产生胰岛素抵抗，即表现为其胰岛素受体与胰岛素的结合能力减弱，当分泌相同剂量的胰岛素时，产生降低血糖的效应也会降低[16-18]。虽然胰岛素抵抗最终也会表现出高血糖的体征，但此过程需要较长的时间才能够出现。大多数糖尿病动物模型建立实验，对时间都会有所要求，都希望能够缩短实验时间，所以模型组采用高糖高脂饮食诱导和药物干预相结合的方法 ，将成年SD 大鼠高糖高脂饮食诱导一段时间，以诱导出胰岛素抵抗，再联合腹腔注射小剂量的链脲佐菌素，以此来加速糖尿病的进程，最终建立2 型糖尿病大鼠模型，该方法具有制造方法简便、药物毒性低、特异性高等优点。经典的糖尿病诊断标准为：典型糖尿病症状(多饮、多尿、多食、不明原因的体质量下降)加上随机血糖≥11.1 mmol/L或加上空腹血糖≥7.0 mmol/L[19-20]。对于此次实验糖尿病的诊断，研究选择在造模后3，7，10，14，21 d，对模型组大鼠的体质量及血糖进行测量及造模前、造模后每日对大鼠生命体征等一般状况进行观察比较，结果表明模型组大鼠血糖明显升高，体质量呈现出先下降、后稍回升的趋势，体型消瘦，每日饮水量、饮食量及尿量明显增多；造模后3，7，10，14，21 d 后连续3 次测得空腹血糖均≥ 16.7 mmol/L；这些生命体征表现都与临床上 2 型糖尿病患者的临床表现及症状相近。以上结果说明了模型组大鼠已具有了糖尿病症状及表现，并且模型组大鼠的发病过程及临床表现与2 型糖尿病相类似，这与实验的预期结果相同。由于2 型糖尿病具有较多的发病原因，因此无论是诱导性、自发性、遗传性还是转基因动物模型，都不可能将糖尿病的发病及发展过程完全表现出来[21]。而此次实验通过给予高糖高脂饮食并结合链脲佐菌素建立了大鼠糖尿病模型，该模型的发病过程及临床表现与人类糖尿病相类似，因而可以用于糖尿病及其并发症的相关研究。此外，该模型动物不需要使用药物来维持生命时间，这与其他实验相比较，具有独特优势，虽然部分模型大鼠血糖与之前比较稍有所降低，但仍然高于对照组的正常水平，这与临床上2 型糖尿病患者早期通过减轻体质量来改善胰岛素抵抗的表现相类似。目前对骨质疏松的评价，DEXA 法测量骨密度是大多数相关报道的常用评价方法，但是此方法存在不能完全体现骨强度的变化以及无法反映骨结构的缺点[22]。目前也有相关文献报道采用 Micro-CT 扫描技术来评价小动物骨质疏松症。Micro-CT 检查是一种非侵入性、非破坏性的高分辨率检查骨骼微结构的方法[23]。此次实验亦采用Micro-CT 扫描技术来评价大鼠的骨质疏松症，一方面，Micro-CT 能够将大鼠骨骼的三维解剖结构清晰地呈现出来，从不同角度观察大鼠骨质的变化；另一方面，通过Micro-CT 扫描，可以测定大鼠的骨体积、骨小梁数量及骨小梁间距值，通过统计学分析，模型组与对照组比较，差异有显著性意义。实验对骨质疏松症鉴定的另外一个方法为制作股骨组织切片，造模后8 周，取两组大鼠股骨组织切片进行苏木精-伊红染色和Masson 染色，通过比较发现，与对照组相比，模型组大鼠骨髓腔明显增大、骨小梁间距明显加宽，骨小梁变细、断裂，骨小梁之间明显疏松紊乱，这些均是典型的骨质疏松改变，与Micro-CT 扫描结果相一致，证明了骨质疏松模型建立的成功。综上所述，从形态学、组织学、影像学等几方面结果可以得出，高糖高脂饮食诱导联合小剂量链脲佐菌素(35 mg/kg)可以成功建立2 型糖尿病骨质疏松症大鼠模型，该模型的建立为后续研究糖尿病骨代谢奠定了基础。作者贡献：通讯作者设计实验并负责论文审校，第一作者进行实验实施及撰写论文，其他作者均为实验参与者。经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金项目(81870746，81371125)”的资助。所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。机构伦理问题：实验方案经西南医科大学动物实验伦理委员会批准。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。开放获取声明：这是一篇开放获取文章，根据《知识共享许可协议》“署名-非商业性使用-相同方式共享4.0”条款，在合理引用的情况下，允许他人以非商业性目的基于原文内容编辑、调整和扩展，同时允许任何用户阅读、下载、拷贝、传递、打印、检索、超级链接该文献，并为之建立索引，用作软件的输入数据或其它任何合法用途。4 参考文献 References[1] 夏维波,章振林,林华,等.原发性骨质疏松症诊疗指南(2017)[J].中国骨质疏松杂志,2019,25(3):281-309.[2] MOHSIN S, KAIMALA S, SUNNY JJ, et al.Type 2 Diabetes Mellitus Increases the Risk to Hip Fracture in Postmenopausal Osteoporosis by Deteriorating the Trabecular Bone Microarchitecture and Bone Mass.J Diabetes Res.2019;2019:3876957.[3] 杨蕾,付勤.2 型糖尿病性骨质疏松骨质量改变研究[J].中华骨质疏松和骨矿盐疾病杂志,2019,12(1):100-108.[4] STARR JESSICA F, BANDEIRA LEo
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文章来源：中国骨质疏松 网址: http://zggzss.400nongye.com/lunwen/itemid-6878.shtml
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